支原體污染一般會(huì)呈現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差、生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會(huì)有小黑點(diǎn)，但培養(yǎng)基一般不渾濁，細(xì)胞傳代以后就出現(xiàn)細(xì)胞間黑點(diǎn)、細(xì)胞空泡化或者很多類似凋亡、壞死的細(xì)胞，最終細(xì)胞漂浮，完全死亡。

支原體污染需要實(shí)驗(yàn)室及培養(yǎng)箱進(jìn)行滅菌處理，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境可采用84消毒以及臭氧，培養(yǎng)箱用酒精進(jìn)行擦拭后再使用，再有就是操作及使用的耗材，像移液槍及移液管在使用上需要注意。

建議細(xì)胞使用3個(gè)月后更換（傳代20次左右），不斷利用同一株細(xì)胞，細(xì)胞會(huì)不斷衰老，對實(shí)驗(yàn)效果不佳。

此現(xiàn)象是正常的，細(xì)胞可能處于分裂階段，會(huì)出現(xiàn)呈葡萄的黏連現(xiàn)象，若細(xì)胞出現(xiàn)致密的球狀結(jié)團(tuán)，則細(xì)胞活率可能會(huì)下降，注意檢查各培養(yǎng)條件是否正常，如搖床轉(zhuǎn)數(shù)是否過高，細(xì)胞傳代是否不及時(shí)等。

一般培養(yǎng)基中大多數(shù)使用HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO₃的含量決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)CO₂的濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO₃含量為每公升3.7g時(shí)，采用10%CO₂；培養(yǎng)基中NaHCO₃含量為每公升1.5g時(shí)采用5%CO₂。

若使用珠海愷瑞的凍存液KD-Freeze，解凍復(fù)蘇時(shí)無需離心去除DMSO；

若使用自配的凍存液，可離心去除DMSO再進(jìn)行用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；或直接培養(yǎng)在新鮮培養(yǎng)液中，待隔天置換新鮮培養(yǎng)液以去除DMSO（可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或離心對細(xì)胞造成物理性傷害以及細(xì)胞流失）。

細(xì)胞復(fù)蘇不起來時(shí)首先要檢查培養(yǎng)件是否有誤，如溫度37℃；濕度穩(wěn)定；搖床轉(zhuǎn)速120rpm(振幅為26mm，若振幅為50mm，則換算轉(zhuǎn)速為85-90rpm)；其次，細(xì)胞凍存時(shí)的狀態(tài)是否穩(wěn)定；或復(fù)蘇時(shí)水浴溫度距37℃上下差距較大或水浴時(shí)間過長，另外凍存時(shí)間過長對細(xì)胞也有一定的損傷，凍存液中的成分對細(xì)胞生長也有較輕的抑制效果。

出現(xiàn)復(fù)蘇1-2代細(xì)胞活率逐漸下降，此時(shí)可以先把細(xì)胞轉(zhuǎn)至方瓶放置靜止培養(yǎng)箱，再觀察狀態(tài)；待細(xì)胞狀態(tài)回復(fù)后，重新轉(zhuǎn)搖瓶培養(yǎng)。

進(jìn)行細(xì)胞種子保存時(shí)，請按說明書中推薦的細(xì)胞凍存密度將細(xì)胞離心，再加入珠海愷瑞自主研發(fā)的無血清細(xì)胞凍存液，而后依次放置于-80℃冰箱和液氮罐保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)不需要對融化后的細(xì)胞進(jìn)行離心除去細(xì)胞凍存液這一步操作，直接將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到小體積搖瓶進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)三至四天后進(jìn)行傳代，細(xì)胞活率恢復(fù)后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，避免造成對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)需要注意選擇細(xì)胞的傳代接種密度、傳代時(shí)機(jī)以及密切關(guān)注細(xì)胞活率等事項(xiàng)。以珠海愷瑞馴化篩選的HEK293為例，此細(xì)胞生長周期為9-10天，傳代時(shí)細(xì)胞接種密度為0.3-0.5×106個(gè)/毫升，細(xì)胞傳代時(shí)期是細(xì)胞正處于指數(shù)增長期，此時(shí)細(xì)胞活率應(yīng)在98%以上，細(xì)胞密度為4-6×106個(gè)/毫升（即培養(yǎng)三到四天進(jìn)行傳代）。傳代培養(yǎng)過程中要密切注意細(xì)胞的活率狀態(tài)，若活率下降，需先檢查各個(gè)培養(yǎng)條件是否發(fā)生了變化，若無，則對細(xì)胞進(jìn)行離心處理，在小體積搖瓶中傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

珠海愷瑞開發(fā)的無血清化學(xué)限定培養(yǎng)液采用自主研發(fā)配方，且不含抗結(jié)團(tuán)劑及其它蛋白添加因子，所提供的細(xì)胞生長環(huán)境與其它品牌產(chǎn)品明顯不同，因此在更換培養(yǎng)液時(shí)細(xì)胞容易出現(xiàn)短暫的不適應(yīng)現(xiàn)象。用戶在更換使用珠海愷瑞培養(yǎng)液時(shí)若出現(xiàn)上述現(xiàn)象，可將新、舊培養(yǎng)液混合后使用并逐步減低原來培養(yǎng)液體積比例，待細(xì)胞過渡到新培養(yǎng)液后，讓細(xì)胞在新的培養(yǎng)液中持續(xù)傳代數(shù)周時(shí)間，等細(xì)胞的生長速度及密度恢復(fù)至正常狀態(tài)再做下一步的實(shí)驗(yàn)。在此期間，我們會(huì)安排技術(shù)人員及時(shí)解答用戶所遇到的問題，確保細(xì)胞培養(yǎng)的成功。

不需要，珠海愷瑞開發(fā)的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基系列均不需要提前預(yù)熱，4℃冰箱中取出即可直接使用，不會(huì)對細(xì)胞造成損害導(dǎo)致大面積死亡。

不可以進(jìn)行紫外照射，在紫外照射下，部分營養(yǎng)添加劑/細(xì)胞因子中蛋白成分會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變，降低使用效果或?qū)?xì)胞產(chǎn)生毒性；培養(yǎng)基經(jīng)紫外線照射，其中營養(yǎng)成分可能發(fā)生改變，如某些氨基酸發(fā)生化學(xué)活化，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響細(xì)胞正常生長。

若轉(zhuǎn)染后出現(xiàn)松散的細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，可能是細(xì)胞成團(tuán)粘附于瓶壁上并在震動(dòng)中脫落下來所致，這種情況多數(shù)是搖瓶本身不干凈或細(xì)胞存活率低而引起。在轉(zhuǎn)染后，若轉(zhuǎn)染后細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象比較嚴(yán)重，可在轉(zhuǎn)染1天后加入適量抗結(jié)團(tuán)劑（例如25mg/L左右的硫酸葡聚糖），以緩解或消除細(xì)胞結(jié)團(tuán)。

因本系統(tǒng)使用的方法為高細(xì)胞密度轉(zhuǎn)染，在20×10⁶個(gè)/ml密度條件下培養(yǎng)可能會(huì)出現(xiàn)輕微掛壁情況，這屬于正常情況，可繼續(xù)進(jìn)行下一步操作。

質(zhì)粒提取一般選擇無內(nèi)毒素的大提試劑盒，內(nèi)毒素的含量越低越好，愷瑞非定制的培養(yǎng)基KOP293內(nèi)毒素含量低于10EU/ml。

質(zhì)粒濃度我們建議在1mg/ml，如果轉(zhuǎn)染密度在2x10⁶個(gè)/ml，這個(gè)質(zhì)粒濃度量是足夠的，如果用戶提高轉(zhuǎn)染密度，對應(yīng)的也可以適當(dāng)調(diào)整質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑比例。常規(guī)轉(zhuǎn)染可按照我們推薦的濃度即可。超螺旋比例越高越好。

通常表達(dá)峰值在3-4天，這個(gè)期間如果細(xì)胞活率下降會(huì)很大影響得率，最優(yōu)的收樣條件在5-6天左右，活率在70-80%。

正常，收樣時(shí)的顏色差異主要與pH有關(guān)，導(dǎo)致這種的原因，主要還是要看當(dāng)時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞狀態(tài)不好就有可能偏酸，就算轉(zhuǎn)染同一個(gè)質(zhì)粒同一個(gè)細(xì)胞也會(huì)有這種情況發(fā)生；與質(zhì)粒也有關(guān)系。

根據(jù)不同質(zhì)粒的表達(dá)水平不同，293表達(dá)量大概在1-600mg/L，CHO表達(dá)量大概在1-400mg/L；在質(zhì)粒同等表達(dá)水平下，建議使用293系統(tǒng)表達(dá)；若在293系統(tǒng)表達(dá)下，表達(dá)量相對較低，建議使用Hi-KDCHO高密度瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)表達(dá)；Hi瞬轉(zhuǎn)表達(dá)比正常CHO瞬轉(zhuǎn)表達(dá)產(chǎn)量高10倍左右。

不是增強(qiáng)轉(zhuǎn)染，是增強(qiáng)蛋白表達(dá)。主要作用是延緩細(xì)胞分裂，抑制細(xì)胞快速生長，從而促進(jìn)蛋白表達(dá)、增加蛋白產(chǎn)量。

KT-Feed對CHO及HEK293細(xì)胞都適用，是一種植物蛋白營養(yǎng)添加劑，可補(bǔ)充細(xì)胞所需營養(yǎng)提高細(xì)胞表達(dá)量；據(jù)本公司的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：添加KT-Feed能提高1/3-1倍的表達(dá)量，但由于蛋白表達(dá)結(jié)果受多方面的因素影響（z細(xì)胞生長狀況、質(zhì)粒表達(dá)水平等），具體增加的蛋白表達(dá)結(jié)果視實(shí)際情況而定。

轉(zhuǎn)染試劑染的原理：不是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，我們的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染的。

經(jīng)多次驗(yàn)證，使用珠海愷瑞的293細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其最佳收樣時(shí)間為轉(zhuǎn)染后的第六天，但由于用戶表達(dá)的蛋白大小及性質(zhì)不盡相同，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)染后存活時(shí)間長短不一，因此收樣時(shí)間應(yīng)視情況而定，建議收樣時(shí)細(xì)胞活率不要低于70%。

通常情況下細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后活率不會(huì)有太大的降低，若出現(xiàn)細(xì)胞活率急劇下降，首先檢查培養(yǎng)條件是否有誤，其次需檢查所使用的轉(zhuǎn)染試劑量是否過量，過量的轉(zhuǎn)染試劑或者轉(zhuǎn)染復(fù)合物都會(huì)導(dǎo)致活率下降。

也可以，但建議把sp2/0馴化至無血清再做小鼠融合，以便后續(xù)雜交瘤細(xì)胞馴化難降低。

雜交瘤細(xì)胞在1%FBS條件下傳代1-2次，再進(jìn)行降無血清。細(xì)胞在沒完全適應(yīng)低血清條件下生長，直接降無血清很難生長起來。

ITSplus與KD-HybriGro用途不同，ITSplus基礎(chǔ)添加因子，主要應(yīng)用于細(xì)胞無血清馴化及培養(yǎng)，在細(xì)胞克隆提高方面效果不明顯，KD-HybriGro含重組白介素組合因子，可明顯促進(jìn)雜交瘤單細(xì)胞生長，配合1%FBS主要用于雜交瘤細(xì)胞單克隆培養(yǎng)，同時(shí)也可用于細(xì)胞馴化及融合培養(yǎng)。

KTM2是市面上1640、DMEM、IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良的低密度無血清培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分上與它們區(qū)別較大，更適宜在方瓶中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞；

KD-Clone是單細(xì)胞克隆培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分比KTM2低，適合單細(xì)胞生長；適用于其他類型細(xì)胞克隆時(shí)的培養(yǎng)液。

KD-Hybri是高密度無血清培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分比其他兩種更復(fù)雜，適用于骨髓瘤/雜交瘤細(xì)胞生長。

ITSplus中含有骨髓瘤/雜交瘤細(xì)胞生長因子，但此因子穩(wěn)定性欠佳，不能直接事先配入KD-Hybri中。所以KD-Hybri添加了ITSplus細(xì)胞才能生長，單獨(dú)的KD-Hybri不能培養(yǎng)骨髓瘤/雜交瘤細(xì)胞。

細(xì)胞上搖瓶的原則是，先維持低濃度血清，不低于0.5×10⁶個(gè)/ml的密度上搖瓶，讓細(xì)胞在初次上搖瓶時(shí)，仍保持對數(shù)生長速度，細(xì)胞密度增加，活率變化不大之后，再在搖瓶中逐步降血清，這樣的成功率會(huì)比較高。

通常來說，可以直接用KD-Hybri代替DMEM，血清的濃度先維持不變，看細(xì)胞適應(yīng)后，在開始逐步減血清。

在擴(kuò)增培養(yǎng)轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)，盡量在細(xì)胞生長狀態(tài)良好且細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右進(jìn)行，匯合度過高或過低均不利于細(xì)胞擴(kuò)增。

細(xì)胞傳代要及時(shí)并選擇對數(shù)生長期進(jìn)行傳代。不同克隆的雜交瘤細(xì)胞生長速率不同，對無血清培養(yǎng)系統(tǒng)適應(yīng)能力不同，最高生長密度也會(huì)有不同。

雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定性較差，無血清持續(xù)馴化過程中可能會(huì)引起陽性細(xì)胞丟失，若遇到這種情況可通過對細(xì)胞進(jìn)行多次單克隆以提高其陽性特性。

進(jìn)行無血清馴化時(shí)必須保證細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞活率在85%以上時(shí)方可進(jìn)行。切換成無血清培養(yǎng)后細(xì)胞一開始活率下降是細(xì)胞正在適應(yīng)無血清環(huán)境的正?，F(xiàn)象，此時(shí)需重點(diǎn)監(jiān)測細(xì)胞后續(xù)是否有增殖、活率是否在逐漸回升。若細(xì)胞活率低于50%應(yīng)補(bǔ)回2%血清，傳代2-3代，待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后再進(jìn)行無血清馴化。

雜交瘤細(xì)胞一般可以直接從靜置培養(yǎng)轉(zhuǎn)換到搖瓶懸浮震蕩培養(yǎng)，在此過程中細(xì)胞需要先通過靜置培養(yǎng)逐級擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量較多時(shí)再進(jìn)行懸浮震蕩培養(yǎng)。細(xì)胞接種到搖瓶時(shí)請將培養(yǎng)液切換成KD-Hybri，此時(shí)培養(yǎng)基血清含量可降至2%。