■   知識(shí)點(diǎn)

      His標(biāo)簽蛋白哺乳動(dòng)物細(xì)胞

無(wú)血清培養(yǎng)表達(dá)和純化      

·  轉(zhuǎn)染系統(tǒng)

      隨著生物制藥和細(xì)胞治療產(chǎn)品的需求不斷增加，利用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)表達(dá)和純化單克隆抗體及抗原等各種類(lèi)型重組蛋白的技術(shù)已經(jīng)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，珠海愷瑞擁有完整的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)重組蛋白表達(dá)和純化試劑及技術(shù)，可幫助客戶(hù)實(shí)現(xiàn)各種重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)表達(dá)和純化。

·  蛋白表達(dá)及純化

       重組蛋白的細(xì)胞表達(dá)需要先構(gòu)建蛋白表達(dá)質(zhì)粒，然后選擇合適的細(xì)胞例如HEK293或CHO細(xì)胞，使用PEI等化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑或電轉(zhuǎn)儀將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。

      單克隆抗體的表達(dá)除了可以使用重組基因表達(dá)方法以外，還可以通過(guò)對(duì)雜交瘤細(xì)胞的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)來(lái)獲得高效表達(dá)。重組單克隆抗體及雜交瘤細(xì)胞單抗的純化主要依靠蛋白A親和層析實(shí)現(xiàn)，方法簡(jiǎn)單可靠，較少出現(xiàn)技術(shù)問(wèn)題。

      其它類(lèi)型的重組蛋白純化較多使用蛋白標(biāo)簽親和層析法，通過(guò)在蛋白一端連接一段蛋白標(biāo)簽和使用標(biāo)簽蛋白特異結(jié)合填料來(lái)完成重組蛋白的純化，其中His標(biāo)簽和相對(duì)應(yīng)的鎳填料層析可能最為常用。

·  His標(biāo)簽蛋白

      His標(biāo)簽蛋白組氨酸咪唑環(huán)可特異結(jié)合層析填料中的鎳金屬，并可利用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫下來(lái)。His標(biāo)簽蛋白的純化基本操作流程為：柱平衡、上樣、洗雜、洗脫、柱再生。將樣品調(diào)節(jié)至與平衡液相同的 pH，先后用5CV100%洗脫液及平衡液進(jìn)行平衡，平衡完畢后進(jìn)行上樣。洗雜時(shí)可使用5%洗脫液進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)洗雜，洗去一些結(jié)合不牢的雜蛋白成分，再使用100%洗脫液將目的蛋白洗下收集，最后用5CV洗脫液及5CV平衡液再生柱子。

·  純化His標(biāo)簽蛋白時(shí)較易出現(xiàn)各種技術(shù)問(wèn)題

    1.如果洗脫組分不純，可增加洗雜液的體積、調(diào)節(jié)pH及咪唑濃度、增加一步純化如離子交換疏水層析等。或?qū)悠愤M(jìn)行初步純化如AS或PEI沉淀后再利用親和層析完成純化過(guò)程；

    2.若洗脫組分中無(wú)目的蛋白或蛋白量過(guò)低，可通過(guò)Western Blotting方法對(duì)His標(biāo)簽蛋白表達(dá)和純化樣品進(jìn)行定性和定量分析。如果蛋白表達(dá)量過(guò)低，則可嘗試改變和優(yōu)化表達(dá)條件來(lái)提高產(chǎn)量；如果蛋白表達(dá)量正常但是純化效果不佳，則可嘗試降低洗雜液濃度、提高洗脫液濃度以防止結(jié)合較弱或過(guò)強(qiáng)的目的蛋白的損失；

    3.倘若上樣過(guò)程中出現(xiàn)蛋白沉淀現(xiàn)象，則可能是操作溫度太低，可以待樣品恢復(fù)至室溫后上樣。也可考慮在樣品或緩沖溶液中添加穩(wěn)定劑。

        純化后的樣品可通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳等方法對(duì)蛋白純度及分子量進(jìn)行測(cè)定。為了避免反復(fù)凍融對(duì)蛋白造成的影響可將純化后的蛋白除菌后，分裝成小份，按需取用，或使用冷凍干燥等方法將蛋白長(zhǎng)期保存。

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