本系統(tǒng)適合于HEK-293細(xì)胞及其它293細(xì)胞的高密度懸浮培養(yǎng)、DNA瞬時轉(zhuǎn)染及蛋白表達(dá)。

本實驗方法根據(jù)HEK-293細(xì)胞的錐形瓶懸浮培養(yǎng)經(jīng)驗總結(jié)而成，也適用于其它懸浮培養(yǎng)方式的293細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染及蛋白表達(dá)。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備

1、轉(zhuǎn)染前需確定細(xì)胞密度及存活率。為確保轉(zhuǎn)染效果，建議使用生長處于指數(shù)期（密度約為2~4×10^6個/毫升）、存活率大于98% 的細(xì)胞；

2、轉(zhuǎn)染前細(xì)胞無需離心。若細(xì)胞密度為2.0×10^6個/ml時，則可直接轉(zhuǎn)染，若細(xì)胞密度>2.0×10^6個/ml，則需兌入新鮮的KOP293培養(yǎng)液，將細(xì)胞密度稀釋成2×10^6個/毫升?？蛻粢部筛鶕?jù)自身經(jīng)驗摸索合適的轉(zhuǎn)染密度；

3、細(xì)胞準(zhǔn)備好后恒溫震蕩培養(yǎng)10min后開始轉(zhuǎn)染（5%CO2，37℃、120rpm）。

瞬時轉(zhuǎn)染（以轉(zhuǎn)染100ml細(xì)胞懸液為例）

1、準(zhǔn)備兩支15ml無菌離心管，在其中一支中加入5ml KPM和100μg無菌質(zhì)粒DNA，輕輕吹打混勻。取另一支離心管，加入5ml KPM和500μl TA-293轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻；

2、將含有轉(zhuǎn)染試劑的離心管中所有液體轉(zhuǎn)移至含質(zhì)粒的離心管中，輕輕吹打混勻；

3、將質(zhì)粒-載體復(fù)合物室溫下靜置孵育10分鐘；

4、從恒溫?fù)u床中取出細(xì)胞，邊搖邊加入制備好的質(zhì)粒-載體復(fù)合物，放回CO2恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)。3小時后可根據(jù)需要加入適量抗生素。

產(chǎn)物表達(dá)與檢測

1、轉(zhuǎn)染24小時后加入600 μl 293細(xì)胞蛋白表達(dá)增強劑（KE-293），以增加產(chǎn)物表達(dá)量； 

2、可選擇在轉(zhuǎn)染24小時后添加一次瞬時轉(zhuǎn)染營養(yǎng)添加劑(KT-Feed 50×)，適當(dāng)提高產(chǎn)物的表達(dá)量； 

3、根據(jù)產(chǎn)品特性，在轉(zhuǎn)染后第2至6天測定產(chǎn)物表達(dá)量； 

4、多數(shù)重組蛋白的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后第6天左右可達(dá)到最高值，客戶可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及表達(dá)量選擇適宜的收獲時間。

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